อิเล็กโตรโฟรีซิส

อิเล็กโตรโฟรีซิส (Electrophoresis) เป็นเทคนิคที่ใช้แยกสาร วิเคราะห์ และเตรียมสารที่มีประจุไฟฟ้า เช่น กรดอะมิโน โปรตีน และ กรดนิวคลีอิก ให้บริสุทธิ์ โดยอาศัยหลักการที่ว่า เมื่อให้สนามไฟฟ้า สารที่มีประจุไฟฟ้าจะเคลื่อนที่ไปยังขั้วที่ตรงข้ามกันด้วย อัตราเร็วในการเคลื่อนที่ ซึ่งขึ้นกับปริมาณประจุสุทธิบนโมเลกุลของสาร รูปร่างและขนาดของโมเลกุลของสารนั้น และกระแสไฟฟ้า

ทฤษฎี

อัตราเร็วในการเคลื่อนที่ของสารแสดงด้วยสมการดังนี้ V=E.q/f เมื่อ

• v=ความเร็วในการเคลื่อนที่ของโมเลกุล
• E=ความเข้มของสนามไฟฟ้า
• q=ประจุสุทธิบนโมเลกุล
• f=frictional coefficient ขึ้นอยู่กับน้ำหนักและรูปร่างโมเลกุล

การเคลื่อนที่ของโมเลกุลที่มีประจุในสนามไฟฟ้าแสดงโดยเทอมของ การเคลื่อนที่ในสนามไฟฟ้า,u ซึ่งหมายถึงความเร็วต่อหน่วยของความเข้มของสนามไฟฟ้า ซึ่งขึ้นตรงกับ อัตราส่วนประจุ/มวล u=v/E=E . q/f . Eเมื่อ v=E.q/f u=q/f

f จะแปรตามขนาดไม่ได้แปรตามรูปร่าง

การแยกทางไฟฟ้าโดยใช้เจล

การแยกทางไฟฟ้าโดยใช้เจล (Gel Electrophoresis) มีหลายชนิดดังนี้

1. แบบคอลัมน์ (Column Gel Electrophoresis) เจลถูกทำให้แข็งตัวในคอลัมน์และนำไปจุ่มอยู่ใน buffer ทั้งปลายบน และปลายล่าง สารผสมที่ต้องการแยกถูก ปล่อยลงบนผิวหน้าของเจลที่อยู่ปลายบน เมื่อให้สนามไฟฟ้า สารผสมจะแยกออกจากกันเป็นแถบ ที่ใช้ทั้งในตัวกลางเจลและในอ่างมี pH ประมาณ 9 ทำให้ protein มีประจุสุทธิเป็นลบจึงเคลื่อนที่เข้าหาขั้วบวก
2. Slab Gel Electrophoresis การทำ electrophoresis เหมือนกับ แบบคอลัมน์ แต่มีข้อดีกว่า คือ สามารถแยก และวิเคราะห์สารได้พร้อมกัน เป็นจำนวนมาก ในเจลแผ่นเดียวกันทั้ง column และ slab gel สารผสมที่ต้องการแยก ต้องใส่กลีเซอรอลหรือน้ำตาลซูโครสเพื่อเพิ่มความหนาแน่น ทำให้ไม่เกิดการแพร่กระจายของสารผสมใน บัฟเฟอร์ และต้องใส่ ประจุบวกที่ละลายน้ำหรือ สีติดตามประจุลบด้วย สีย้อมนี้เคลื่อนที่ได้เร็วกว่า ประจุขนาดใหญ่ ส่วนใหญ่จึงทำให้ เห็นการเคลื่อนที่ระหว่างการทำจนสีย้อมเคลื่อนที่มาถึงปลายสุดของแผ่นเจลจึงจะสิ้นสุดการทำอิเล็กโตรโฟรีซิสและทำการย้อมเจลด้วยสีที่จับกับสารจะได้ แถบของสารที่ต้องการ
   1. Polyacrylamide gel electrophoresis เป็น cross-inked polymer ที่เกิดจากการสร้าง polymer ระหว่าง acrylamide monomer กับ bis โดยมี temed เป็น catalyst และมี ammonium persulfate หรือ riboflavin เป็น initiator ตัวกลางค้ำจุน ทำหน้าที่เป็น molecular sieve ช่วยในการแยกสารออกจากกันได้ โมเลกุล ขนาดเล็กกว่ารูพรุนของเจลจะ เคลื่อนที่ผ่านเจลไปได้ ในขณะที่โมเลกุลที่มีขนาดใหญ่กว่ารูพรุนจะถูกขัดขวางการเคลื่อนที่ส่วนโมเลกุลขนาด กลางสามารถผ่านรูพรุนได้ แต่ไม่ดีเท่าขนาดเล็ก ขนาดของรูพรุนสามารถปรับได้ตามความเข้นข้นของ acrylamide และ bis
   2. อิเล็กโตรโฟรีซิสแบบไม่ต่อเนื่อง (Discontinuous Gel Electrophoresis หรือ Dis Gel Electrophoresis) เป็น อิเล็กโตรโฟรีซิสที่มี pHไม่สม่ำเสมอ เรียกว่า discontinuous ซึ่งใช้ polyacrylamide เป็นตัวกลางเจล ทำได้ทั้งแบบ column gel และ slab gel โดยแบ่งเจลออก เป็น 3 ส่วน คือ sample gel อยู่บนสุดอาจมีหรือไม่มีก็ได้ stacking gel หรือ spacer gel อยู่ตรง กลางและ separating gel หรือ running gel อยู่ล่างสุด sample gel และ stacking gel มีขนาดรูพรุน ใหญ่กว่า separating gel และสารละลาย buffer ที่ใช้เตรียม เจลทั้ง 2 มีค่า ionic strength และ pH ที่ต่ำกว่า ทำให้มีความต้านทานไฟฟ้า และ สนามไฟฟ้าสูงกว่า ด้วยเหตุนี้จึงทำให้การเคลื่อนที่ของโมเลกุลในเจลทั้ง 2 ส่วนเร็วกว่าในส่วน separating gel โมเลกุลของสารจะเคลื่อนที่ อย่างรวดเร็ว และถูกบีบให้รวมกันเป็น band แคบ ๆ ในส่วนของ stacking gel และเมื่อสารเข้าสู่ separating gel โมเลกุลจะเคลื่อน ที่ช้าลง เนื่องจากรูพรุนของเจล เล็กลง และจะถูกแยกออกจากกันด้วยหลักของ electrophoresis
   3. Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) เป็นเทคนิคที่ใช้วิเคราะห์หาน้ำหนักโมเลกุลของพอลิเพปไทด์สายเดี่ยว โดยอาศัยหลักว่า สารตัวอย่าง อยู่ในสารละลายบัฟเฟอร์ที่มี pH เป็นด่างและประกอบด้วย sodium dodecyl sulfate (SDS) ซึ่งเป็น anionic detergent ที่มีประจุลบที่สามารถแยกพอลิเพปไทด์ ที่อยู่รวมกันออกเป็นสายเดี่ยวมีโครงสร้างเป็น แท่งและทุกสายมีประจุลบจึงเคลื่อนที่เข้าหา ขั้วบวก (SDS จับพอลิเพปไทด์คงที่ ด้วยอัตราส่วน 1.4 กรัมSDS /กรัมโปรตีน โดยมี เบตา-mercaptoethanol เป็น reducing agent ในสารตัวอย่างด้วยเพื่อใช้ทำลายพันธะ disulfide ในโปรตีน อัตราการเคลื่อนที่ของพอลิเพปไทด์จะเร็วหรือช้าขึ้นกับขนาดหรือน้ำหนักโมเลกุล ผลของการแยกโปรตีน สามารถมองเห็น band พอลิเพปไทด์เมื่อย้อมสีด้วย Coomassie blue และ หาน้ำหนัก โมเลกุลของพอลิเพปไทด์แต่ละสายของสารตัวอย่างได้โดยสร้างกราฟความสัมพันธ์ ระหว่าง log ของน้ำหนักโมเลกุล กับอัตราเร็วของการเคลื่อนที่ของโปรตีนมาตรฐาน และเมื่อทราบ อัตราเร็วของการเคลื่อนที่ในสนามไฟฟ้าของพอลิเพปไทด์ตัวอย่างก็สามารถคำนวณหาน้ำหนัก โมเลกุลได้เมื่อนำมาเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐาน
   4. Native Gel Electrophoresis buffer ของ sample และของ gel ในอ่างมี pH คงที่ ทำให้โปรตีนอยู่ใน native conformation และมี biological activity
3. Agarose Gel Electrophoresis agarose เป็นสายพอลิเมอร์ ของ D-galactose และ 3,6-anhydro-L-galactose เมื่อเตรียมแผ่นเจล โดยต้มสารละลาย agarose ในบัฟเฟอร์แล้วเทลงในถาดเตรียมเพื่อให้แข็งตัวเมื่อเย็น จะได้เจลที่มีรูพรุนใหญ่ จึงใช้แยกสารที่มีขนาดใหญ่ เช่น กรดนิวคลีอิก ซึ่งขนาดรูพรุนขึ้นกับความเข้มข้นของ agarose (เมื่อความ เข้มข้นสูงรูพรุนจะเล็กลง) เมื่อให้สนามไฟฟ้าที่ neutral pH โมเลกุลของกรดนิวคลีอิกจะมีประจุลบและ เคลื่อนที่ไปยังขั้วบวกด้วยความเร็วที่ขึ้นกับขนาดโมเลกุล (molecular size) และโครงรูป (conformation) เมื่อ charge/mass ratio ของกรดนิว คลีอิก = 1 ทำให้อัตราเร็วในการเคลื่อนที่แปรผกผันกับ log10 ของ น้ำหนักโมเลกุลของมัน กรดนิวคลีอิกขนาดเล็กจะเคลื่อนที่ได้เร็วกว่าขนาดใหญ่ และถ้าขนาดเท่ากันแต่มีรูปร่าง ต่างกันจะมีอัตราเร็วต่างกัน โดยลำดับของความเร็วในการเคลื่อนที่ของแต่ละรูปแบบของกรดนิวคลีอิก พบว่า supercoiled DNA > linear double stranded DNA > circular DNA Buffers ที่ใช้ คือ Tris acetate (TAE) Tris borate (TBE) และ Tris phosphate (TPE) ที่ความเข้มข้น 50 mM pH 7.5-8.0 และมี EDTA เพื่อยับยั้ง activity ของ DNase ส่วนสีที่ใช้ย้อมเป็น fluorescent compound (aromatic cation) ที่จับกับ double stranded DNA โดยเข้าไปแทรกตัว (intercalate) อยู่ระหว่าง base pair ที่ซ้อนกัน เช่น เอธิเดียมโบรไมด์ (ethidium bromide) เมื่อฉายแสง UV จะให้ fluorescence มองเห็นเป็น band ของ DNA เรืองแสง

อ้างอิง

http://cyberlab.lh1.ku.ac.th/elearn/faculty/veterin/vet69/Biochemistry%20Web%20Job/electrophoresis/gel%20electrophoresis.htm 2009-04-21 ที่ เวย์แบ็กแมชชีน

http://www.vcharkarn.com/vcafe/166571