Azərbaycanca
Беларускі
Dansk
Deutsch
Española
Français
Indonesia
Italiana
日本語
Қазақ
Lietuvos
Nederlands
Português
Русский
සිංහල
แบบไทย
Türkçe
Українська
中國人
United State
Afrikaans
เอเอฟแอลพี (อังกฤษ: Amplified Fragment Length Polymorphism; ตัวย่อ: AFLP) เป็นเทคนิคของเครื่องหมายดีเอ็นเอ (DNA marker) แบบหนึ่ง พื้นฐานของ AFLP คือการตรวจสอบชิ้นดีเอ็นเอที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ โดยการเพิ่มปริมาณด้วยปฏิกิริยา PCR (Polymerase chain reaction) ดังนั้นจึงรวมเอาความน่าเชื่อถือของเทคนิค RFLP (Restriction fragment length polymorphism) และประสิทธิภาพของ PCR เข้าด้วยกัน เทคนิค AFLP พัฒนาขึ้นโดย Zabeau และ Vos นักวิจัยของบริษัท Keygene N.V. ประเทศเนเธอร์แลนด์ และได้จดสิทธิบัตรในปี ค.ศ.1993
พื้นฐาน
การเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอที่มาจากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ ทำได้โดยการเชื่อมต่อ adapter เข้าที่ปลายของชิ้นดีเอ็นเอต่อจากตำแหน่งตัดจำเพาะของเอนไซม์ โดย adapter เป็นดีเอ็นเอสายคู่ชิ้นสั้น ๆ ที่มีปลายด้านหนึ่งเป็นปลายเหนี่ยว เหมือนกับปลายโมเลกุลของดีเอ็นเอที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะที่เลือกใช้ ดังนั้น จึงสามารถเชื่อมต่อกับชิ้นดีเอ็นเอที่ตัดไว้โดยใช้ปลายเหนี่ยว (sticky end ligation) และจะทำหน้าที่เป็นตำแหน่งที่จับของไพรเมอร์ในการทำ PCR ต่อไป ด้วยวิธีการดังกล่าวนี้ ชิ้นดีเอ็นเอที่ได้จากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะก็จะสามารถเพิ่มปริมาณได้โดยใช้ไพรเมอร์ที่มีลำดับเบสตรงกับส่วนของ adapter รวมกับส่วนของเบสที่ตำแหน่งตัดจำเพาะของเอนไซม์ อย่างไรก็ตาม จำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่สามารถเพิ่มปริมาณได้ในคราวเดียวกันมีมาก และไม่สามารถจะแยกจากกันหรือตรวจสอบโดยวิธีทั่ว ๆ ไป เช่น การทำ ดังนั้นการสังเคราะห์ไพรเมอร์ในการทำ AFLP จึงเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกเข้าที่ปลาย 3’ ต่อจากเบสที่ตำแหน่งตัดจำเพาะของเอนไซม์ เพื่อให้เลือกจับกับชิ้นดีเอ็นเอที่มีลำดับเบสส่วนที่อยู่ต่อจากบริเวณตัดจำเพาะสอดคล้องกับเบสที่เพิ่มเข้าไปที่ปลาย 3’ ของไพรเมอร์นั้นเท่านั้น ทำให้เกิดการเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอเพียงบางส่วนและสามารถกำหนดจำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่ต้องการเพิ่มปริมาณได้โดยจำนวนเบสที่เพิ่มเข้าไปนั่นเอง ถ้าดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตหรือจีโนมที่ศึกษามีส่วนประกอบของเบสทั้ง 4 ชนิด (G, A, C, T) ในสัดส่วนเท่ากัน การเพิ่มเบสเข้าที่ปลาย 3’ ของไพเมอร์เพื่อคัดเลือก 1 เบสจะช่วยลดจำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่จะเพิ่มปริมาณเหลือเพียง 1 ใน 4 ของทั้งหมด ถ้าเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือก 2 เบส จำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่ตรวจสอบได้ก็จะลดลงเหลือ (1/4)2 หรือ 1 ใน 16 ของชิ้นดีเอ็นเอที่ตัดได้ทั้งหมดเท่านั้น ดังนั้น จึงสามารถควบคุมให้เกิดการเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอในจำนวนที่เหมาะสมได้ โดยจำนวนเบสที่เพิ่มเข้าไปแต่ละเบสจะลดปริมาณชิ้นดีเอ็นเอลงเหลือ (1/4)n ของทั้งหมด ( n คือ จำนวนเบสสำหรับคัดเลือกที่เพิ่มขึ้น) ในทางปฏิบัติ ต้องการให้มีจำนวนชิ้นดีเอ็นเอในช่วง 50–100 แถบ ซึ่งเป็นช่วงที่สามารถตรวจสอบได้โดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซิสใน denaturing polyacrylamide gel ในสิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมขนาดเล็กจะใช้ไพรเมอร์ที่มีการเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกจำนวนน้อย เพราะจำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่ได้จากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะมีจำนวนน้อย ในขณะที่การตรวจสอบดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมขนาดใหญ่หรือมีความซับซ้อนมาก ต้องใช้ไพรเมอร์ที่มีการเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกจำนวนมากขึ้น เพื่อปรับจำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่จะเพิ่มปริมาณให้มีจำนวนพอเหมาะ แบบของแถบดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นจากการทำ PCR โดยใช้ไพรเมอร์คู่หนึ่ง ๆ เรียกว่า ลายพิมพ์ AFLP (AFLP fingerprint) ดังนั้นเทคนิค AFLP จึงเป็นวิธีตรวจสอบวิธีหนึ่ง แถบดีเอ็นเอในลายพิมพ์ของแต่ละตัวอย่างบ่งบอกถึงความแตกต่างของชิ้นดีเอ็นเอที่ตัดได้ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ จึงสามารถใช้เป็นเครื่องหมาย เรียกว่า เครื่องหมาย AFLP (AFLP marker) ใช้ศึกษาความหลายหลากของสิ่งมีชีวิตได้เช่นเดียวกับเครื่องหมายดีเอ็นเอแบบอื่น
หลักการทำ AFLP
กระบวนการแบ่งเป็นสามขั้นตอน:
ขั้นแรก
คือการนำดีเอ็นเอมาตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ 2 ชนิด นิยมใช้เอนไซม์ที่มีตำแหน่งจดจำ 6 คู่เบส ซึ่งจะตัดดีเอ็นเอที่ตำแหน่งห่างกันประมาณ 46 (=4,096) คู่เบส เรียกว่า rare cutter ร่วมกับเอนไซม์ที่มีตำแหน่งจดจำ 4 คู่เบส ซึ่งจะตัดดีเอ็นเอที่ตำแหน่งห่างกันประมาณ 44 (=256) คู่เบส เรียกว่า frequent cutter แล้วเชื่อมต่อชิ้นดีเอ็นเอกับ adapter ของเอนไซม์ทั้งสองชนิด เพื่อให้เป็นที่จับของไพรเมอร์ในการเพิ่มปริมาณโดยวิธีการ PCR ในขั้นต่อไป
การตัดดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ 2 ชนิดจะทำให้ได้ขนาดของชิ้นดีเอ็นเอพอเหมาะ และมีข้อดีอีกหลายประการ ดังนี้
- เอนไซม์ตัดจำเพาะที่เป็น frequent cutter จะตัดดีเอ็นเอได้ชิ้นขนาดเล็ก ซึ่งจะเพิ่มปริมาณได้ดีในการทำ PCR และอยู่ในช่วงที่เหมาะสมสำหรับแยกด้วยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซิสโดยใช้ denaturing polyacrylamide gel
- เอนไซม์ตัดจำเพาะที่เป็น rare cutter มีตำแหน่งที่จะตัดดีเอ็นเอได้น้อย จึงช่วยลดจำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่จะเพิ่มปริมาณจากการทำ PCR ลง เนื่องจากชิ้นดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณได้ทั้งหมด หรือเกือบทั้งหมด เป็นชิ้นดีเอ็นเอที่มีปลายด้านหนึ่งเป็นตำแหน่งตัดของเอนไซม์ที่เป็น rare cutter และอีกด้านหนึ่งเป็น frequent cutter ชิ้นดีเอ็นเอที่มีปลายทั้ง 2 ด้านเป็นตำแหน่งของเอนไซม์แบบ frequent cutter เมื่อเชื่อมต่อกับ adapter แล้วจะมีลักษณะเป็นลำดับเบสซ้ำ (inverted repeat) เมื่อถูกทำให้เสียสภาพเป็นสายเดี่ยวจะสามารถกลับมาจับกันเองโดยเบสคู่สม เกิดเป็นโครงสร้างแบบ stem-loop ทำให้ไพรเมอร์ไม่สามารถเข้ามาจับได้ ส่วนชิ้นดีเอ็นเอที่ถูกตัดโดยเอนไซม์ที่เป็น rare cutter ทั้ง 2 ด้านมักจะมีขนาดใหญ่ จึงไม่สามารถเพิ่มปริมาณได้ในสภาวะที่ใช้ทดลอง
- การใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะ 2 ชนิด ในการทำ PCR จะใช้ไพรเมอร์ 2 ชนิดเช่นเดียวกัน ทำให้สามารถเลือกติดฉลากที่ไพรเมอร์ชนิดใดชนิดหนึ่งได้ ดังนั้น จึงมีดีเอ็นเอที่ติดฉลากเพียงสายเดียวเมื่อนำไปแยกขนาดโดย denaturing polyacrylamide gel ดีเอ็นเอทั้ง 2 สายอาจจะเคลื่อนที่ไปได้ระยะทางไม่เท่ากัน เกิดเป็นแถบดีเอ็นเอ 2 แถบคู่กัน (doublet) การวิเคราะห์ผลจึงยุ่งยาก ในกรณีที่มีการติดฉลากเพียงสายเดียว จะตรวจพบแถบดีเอ็นเอเพียงแถบเดียวทำให้วิเคราะห์ได้ง่ายขึ้น
- การใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะ 2 ชนิด ช่วยให้การปรับจำนวนชิ้นดีเอ็นเอ ที่จะเพิ่มปริมาณมีความยืดหยุ่นดี โดยปรับจำนวนเบสเพื่อคัดเลือกที่ไพรเมอร์ทั้ง 2 ชนิดร่วมกัน
- สามารถทำให้เกิดลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่แตกต่างกันได้จำนวนมาก โดยใช้คู่ผสมของไพรเมอร์ทั้ง 2 ชนิดจำนวนน้อย เช่น มีไพรเมอร์ชนิดละ 5 แบบ จากการเพิ่มเบสเพื่อคัดลอก สามารถสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอได้ถึง 25 แบบ เป็นต้น
การใช้ดีเอ็นเอตัดจำเพาะ อาจใช้ชนิดที่เป็น rare cutter ทั้ง 2 ชนิดก็ได้ แต่จะตรวจพบดีเอ็นเอจำนวนน้อย เฉพาะชิ้นที่มีขนาดเล็กเท่านั้น เพราะชิ้นดีเอ็นเอที่มีขนาดเล็กจะเพิ่มปริมาณได้ดีกว่า จึงไม่ค่อยนิยม เอนไซม์ตัดจำเพาะที่ใช้มีหลายชนิด เช่น EcoRI, HindIII, Pstl, Bglll, Xbal (6-cutter) และ Sse 83871 (8-cutter) ร่วมกับ Msel หรือ TaqI ซึ่งเป็น 4-cutter เอนไซม์ MseI มีตำแหน่งจดจำเป็น 5’-TTAA-3’ และ TaqI มีตำแหน่งจดจำเป็น 5’-TCGA-3’ ดีเอ็นเอของยูแคริโอตส่วนใหญ่จะมีองค์ประกอบเป็นเบส A และ T จำนวนมาก (AT rich) เอนไซม์ MseI จึงตัดดีเอ็นเอได้ขนาดเล็กกว่าเอนไซม์ TaqI เมื่อใช้เอนไซม์ TaqI ชิ้นดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณได้มักไม่ค่อยสม่ำเสมอ จะปรากฏเป็นแถบขนาดใหญ่ซึ่งอยู่ส่วนบนของเจล ดังนั้นจึงนิยมใช้เอนไซม์ MseI มากกว่า เพราะตัดดีเอ็นเอได้ขนาดพอเหมาะสำหรับการเพิ่มปริมาณโดยวิธี PCR และการแยกโดยใช้ denaturing polyacrylamide gel สำหรับเอนไซม์ที่เป็น rare cutter นั้นใช้ได้ทั่วไป แต่ที่ใช้เอนไซม์ EcoRI กันมากเนื่องจากมีราคาถูกและการตัดดีเอ็นเอมีประสิทธิภาพดี โดยมีโอกาสพบการตัดไม่สมบูรณ์ได้น้อย
การเชื่อมต่อดีเอ็นเอกับ adapter การตัดดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะและการเชื่อมต่อชิ้นดีเอ็นเอที่ได้กับ adapter สามารถทำพร้อมกันได้ เนื่องจาก adapter ที่สังเคราะห์ขึ้นมานั้น ออกแบบให้มีปลายที่เป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยว มีลำดับเบสเป็นคู่สมกับปลายเหนียวของดีเอ็นเอที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะที่เลือกใช้ แต่เบสคู่ที่อยู่ในตำแหน่งถัดมาเป็นเบสคนละชนิดกับเบสที่บริเวณจดจำของเอนไซม์ ดังนั้นเมื่อ adapter เข้าไปเชื่อมต่อกับชิ้นดีเอ็นเอแล้ว เอนไซม์ตัดจำเพาะนั้นจะไม่สามารถตัดได้อีก แต่ถ้าชิ้นดีเอ็นเอที่ถูกตัดเชื่อมต่อกลับไปใหม่จะสามารถตัดได้อีก การเชื่อมต่อ adapter โดยมีเอนไซม์ตัดจำเพาะอยู่ด้วยจึงไม่มีผลเสียใด ๆ และยังช่วยให้การตัดดีเอ็นเอเกิดได้สมบูรณ์อีกด้วย
ขั้นที่สอง
คือการเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอบางส่วนโดยใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะ ไพรเมอร์ที่ใช้มีลำดับเบสทางปลาย 5’ เหมือนกับลำดับเบสของ adapter ต่อด้วยลำดับเบสบริเวณจดจำหรือบริเวณตัดจำเพาะของเอนไซม์ และเพิ่มเบสเข้าไปที่ปลาย 3’ อีกส่วนหนึ่งเพื่อให้เกิดการคัดเลือกเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอบางชิ้น ส่วนของไพรเมอร์ที่เหมือนกับ adapter และบริเวณจดจำของเอนไซม์ เรียกว่า common part ส่วนเบสที่เพิ่มเข้าไปที่ปลาย 3’ เรียกว่า selective part จำนวนเบสที่เพิ่มเข้าไปที่ปลาย 3’ จะช่วยลดจำนวนดีเอ็นเอที่จะเพิ่มปริมาณลง โดยชิ้นดีเอ็นเอที่จะเพิ่มปริมาณได้ต้องมีลำดับเบสที่อยู่ต่อกับตำแหน่งตัดจำเพาะของเอนไซม์สอดคล้องกับเบสที่เพิ่มเข้าไป ถ้าเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกมากขึ้นจำนวนชิ้นดีเอ็นเอบที่จะเพิ่มจะลดลงประมาณ 4 เท่าต่อทุก ๆ เบสที่เพิ่มขึ้น ในการศึกษาจีโนมขนาดเล็กหรือโคลนที่อยู่ในพลาสมิด คอสมิด หรือ BAC (bacterial artificial chromosome) ไม่จำเป็นต้องเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือก เนื่องจากจำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่เกิดจากการตัดโดยเอนไซม์ตัดจำเพาะมีจำนวนน้อยอยู่แล้ว สิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมขนากไม่ใหญ่มาก เช่น แบคทีเรีย หรือ เชื้อรา จะเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือก 1–2 เบส ส่วนพวกที่มีจีโนมขนาดใหญ่จะเพิ่มเบสมากกว่า 2 เบสที่ไพรเมอร์ทั้งสองชนิด ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกที่ปลาย 3’ จะเรียกว่าเป็นไพรเมอร์ +1, +2, +3 และ +4 ตามลำดับ เช่น ไพรเมอร์ทางปลาย EcoRI adapter จะเรียกว่า EcoRI+1, EcoRI+2, EcoRI+3, EcoRI+4 เป็นต้น
การทำ PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสที่ปลาย 3’ มากกว่า 2 เบส จะทำปฏิกิริยาเพิ่มปริมาณ 2 ครั้ง ครั้งแรก เรียกว่า Preselective amplification และการทำ PCR ครั้งที่ 2 เรียกว่า selective amplification การทำปฏิกิริยา Preselective amplification เป็นการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอต้นแบบให้มากขึ้น และ ช่วยให้เกิดการคัดเลือกเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอที่ถูกต้อง มีการทดลองเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเพียงครั้งเดียวโดยใช้ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสเพื่อคัดเลือก +1, +2, +3 และ +4 เบสตามลำดับ พบว่า จำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณได้ลดลงเป็นลำดับจากการใช้ไพรเมอร์แบบ +1, +2, +3 และ +4 แสดงถึงประสิทธิภาพในการคัดเลือกที่ถูกต้อง แต่ไพรเมอร์ +4 ให้ผลไม่สอดคล้องกัน สามารถตรวจพบแถบดีเอ็นเอจำนวนมากที่ไม่ตรงกับแถบดีเอ็นเอที่เกิดจากการเพิ่มปริมาณโดยไพรเมอร์ +1, +2 และ +3 แสดงว่าเกิดการจับคู่ของเบสที่ไม่ถูกต้อง (mismatch) ในตำแหน่งที่อยู่ห่างจากปลาย 3’ 3 เบส หรือ เบสคัดเลือกตัวแรกที่อยู่ติดกับตำแหน่งตัดจำเพาะนั่นเอง ในการทดลองต่อมา พบว่าการเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกครั้งเดียว 3 เบส ก็ทำให้เกิดการจับคู่ไม่ถูกต้องของเบสที่เพิ่มขึ้นตัวแรกสุดได้เช่นเดียวกันแต่เกิดในความถี่ต่ำ ดังนั้น ถ้าต้องการเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกตั้งแต่ 3 เบสขึ้นไป จึงต้องใช้วิธีเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ 2 ครั้ง โดยครั้งแรกใช้ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสคัดเลือกเพียง 1–2 เบส และครั้งที่ 2 จึงใช้ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสคัดเลือกต่อจากไพรเมอร์ที่ใช้เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในครั้งแรกอีก 1–2 เบส รวมเบสที่เพิ่มเพื่อการคัดเลือก 3–4 เบสตามที่ต้องการ
การทำปฏิกิริยาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป็น 2 ขั้น นอกจากเป็นการประกันว่า การคัดเลือกเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอของไพรเมอร์ที่ใช้เป็นไปอย่างถูกต้อง และมีประสิทธิภาพสูงสุดแล้ว ยังช่วยลด background ที่เป็นพื้นดำในลายพิมพ์ดีเอ็นเอด้วย นอกจากนี้ยังอาจทำ Preselective amplification โดยใช้ไพรเมอร์ที่ไม่มีเบสคัดเลือก (ไพรเมอร์ +0) ได้ในกรณีการวิเคราะห์จีโนมขนาดเล็ก ที่ต้องใช้ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสคัดเลือกจำนวนน้อย เพื่อทำให้ปริมาณดีเอ็นเอเพิ่มมากขึ้น และสามารถตรวจสอบแถบดีเอ็นเอได้ชัดเจนขึ้น
ขั้นสุดท้าย
คือการวิเคราะห์ลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่ได้โดยทำอิเล็กโทรโฟรีซิสใน denaturing polyacrylamide gel แบบเดียวกับที่ใช้หาลำดับเบสของดีเอ็นเอ แถบดีเอ็นเอที่เหมาะสมในการแยก โดยวิธีนี้อยู่ในช่วง 50–100 แถบ การตรวจสอบแถบดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นใช้วิธีการติดฉลากไพรเมอร์ชนิดใดชนิดหนึ่งด้วยสารกัมมันตรังสี หลังจากทำอิเล็กโทรโฟรีซิสเสร็จแล้ว ตรวจผลโดยการทำ หรืออาจใช้วิธีติดฉลากด้วย (fluorescent dye) แล้วตรวจสอบโดยใช้เครื่องหาลำดับเบสแบบอัตโนมัติ (automated sequencer) ก็ได้ จากการที่ต้องตรวจสอบผลการทำ AFLP โดยใช้สารกัมมันตรังสี หรือใช้เครื่องหารลำดับเบสแบบอัตโนมัติ ทำให้เกิดข้อจำกัดในห้องปฏิบัติการหลายแห่ง เนื่องจากขาดประสบการณ์และระบบการปฏิบัติงานที่ใช้สารกัมมันตรังสี หรือไม่สามารถซื้อเครื่องหาลำดับเบสอัตโนมัติที่มีราคาแพงได้ จึงมีการประยุกต์ใช้วิธีตรวจสอบ AFLP ด้วยการโดยใช้โพรบ (Probe) ที่ติดฉลากด้วยสารปลอดรังสี (non radioactive label) หรือวิธีย้อมเจลด้วยซิลเวอร์ไนเตรต (silver staining) ซึ่งให้ผลเป็นที่น่าพอใจ และ สามารถทำได้ในห้องปฏิบัติการทางดีเอ็นเอทั่วไป
ความแตกต่างระหว่างลายพิมพ์ AFLP
คือลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่เกิดจากการทำ AFLP มีลักษณะเป็นลายพิมพ์แบบสุ่ม (random fingerprint) ซื่งใช้กับดีเอ็นเอใด ๆ ก็ได้ ไม่ขึ้นกับขนาดและความซับซ้อนของจีโนม สามารถปรับให้เกิดลายพิมพ์ที่เหมาะสมโดยการปรับจำนวนเบสคัดเลือกที่ปลาย 3’ ของไพรเมอร์ที่ใช้ แม้ว่าวิธีการทำ AFLP จะค่อนข้างยุ่งยาก แต่ผลที่ได้นับว่าดี เพราะสามารถทำซ้ำได้ผลคงเดิม (reproducible) และสามารถเลือกคู่ผสมของไพรเมอร์ได้หลายแบบ ทำให้เกิดลายพิมพ์ดีเอ็นเอจำนวนมาก ในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยไพรเมอร์คู่หนึ่ง ๆ นั้นจะเกิดแถบดีเอ็นเอจำนวนมากในเวลาเดียวกัน แบบของแถบดีเอ็นเอที่แตกต่างกันในแต่ละตัวอย่าง หรือที่เกิดขึ้น มาจากการเปลี่ยนแปลงเบส (point mutation) มีตำแหน่งจดจำของเอนไซม์ ทำให้ตำแหน่งจดจำของเอนไซม์หายไปหรือเกิดขึ้นใหม่ หรือการเปลี่ยนแปลงของเบสที่ตำแหน่งติดกับตำแหน่งจดจำของเอนไซม์ ตรงส่วนที่มีการเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกของไพรเมอร์ที่ใช้ ทำให้สามารถหรือไม่สามารถเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอดังกล่าวแล้วแต่กรณี หรือ อาจเกิดจากมีชิ้นดีเอ็นเอสั้น ๆ ขาดหายไป หรือ สอดแทรกเข้ามา (deletion/insertion) ในระหว่างตำแหน่งตัดจำเพาะของเอนไซม์ ผลที่เกิดขึ้น คือ การมีแถบดีเอ็นเอหรือไม่มีแถบดีเอ็นเอที่ตำแหน่งนั้น ๆ หรือชิ้นดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณได้มีขนาดเปลี่ยนไป การถ่ายทอดลักษณะของแถบดีเอ็นเอจากการทำ AFLP จึงมีทั้งแบบที่แสดงลักษณะข่ม (dominance) โดยปรากฏเป็นการมีหรือไม่มีแถบดีเอ็นเอ และแบบที่แสดงลักษณ์ข่มร่วมกัน (codominance) โดยปรากฏเป็นแถบดีเอ็นเอที่มีขนาดต่างกัน โดยทั่วไปจะพบเครื่องหมาย AFLP (AFLP marker) แบบที่เป็นลักษณะข่มมากกว่า
อ้างอิง
- Zabeau, M and P. Vos. (1993). Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting. European Patent Office, publication 0 534 858 A1, bulletin 93/13.
- Vos P, Hogers R, Bleeker M (พฤศจิกายน 1995). "AFLP: a new technique for DNA fingerprinting". Nucleic Acids Res. 23 (21): 4407–14. doi:10.1093/nar/23.21.4407. PMC 307397. PMID 7501463.
- สุรินทร์ ปิยะโชคณากุล (2009). เครื่องหมายดีเอ็นเอ: จากพื้นฐานสู่การประยุกต์. ภาควิชาพันธุศาสตร์ คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. pp. 103–122. ISBN .
- Meudt HM, Clarke AC (มีนาคม 2007). "Almost forgotten or latest practice? AFLP applications, analyses and advances". Trends Plant Sci. 12 (3): 106–17. doi:10.1016/j.tplants.2007.02.001. PMID 17303467.
บรรณานุกรม
- จรีรัตน์ มงคลศิริวัฒนา (2552). Differential display PCR. สายวิชาวิทยาศาสตร์ คณะศิลปศาสตร์และวิทยาศาสตร์, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ นครปฐม.
แหล่งข้อมูลอื่น
- Step-through animation of PCR – จาก Cold Spring Harbor's Dolan DNA Learning Center (Adobe Flash required)
- เอนไซม์สำหรับ AFLP ที่ New England Biolabs
wikipedia, แบบไทย, วิกิพีเดีย, วิกิ หนังสือ, หนังสือ, ห้องสมุด, บทความ, อ่าน, ดาวน์โหลด, ฟรี, ดาวน์โหลดฟรี, mp3, วิดีโอ, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, รูปภาพ, เพลง, เพลง, หนัง, หนังสือ, เกม, เกม, มือถือ, โทรศัพท์, Android, iOS, Apple, โทรศัพท์โมบิล, Samsung, iPhone, Xiomi, Xiaomi, Redmi, Honor, Oppo, Nokia, Sonya, MI, PC, พีซี, web, เว็บ, คอมพิวเตอร์
exexfaexlphi xngkvs Amplified Fragment Length Polymorphism twyx AFLP epnethkhnikhkhxngekhruxnghmaydiexnex DNA marker aebbhnung phunthankhxng AFLP khuxkartrwcsxbchindiexnexthitddwyexnismtdcaephaa odykarephimprimandwyptikiriya PCR Polymerase chain reaction dngnncungrwmexakhwamnaechuxthuxkhxngethkhnikh RFLP Restriction fragment length polymorphism aelaprasiththiphaphkhxng PCR ekhadwykn ethkhnikh AFLP phthnakhunody Zabeau aela Vos nkwicykhxngbristh Keygene N V praethsenethxraelnd aelaidcdsiththibtrinpi kh s 1993khntxnkartha AFLPphunthankarephimprimanchindiexnexthimacakkartddwyexnismtdcaephaa thaidodykarechuxmtx adapter ekhathiplaykhxngchindiexnextxcaktaaehnngtdcaephaakhxngexnism ody adapter epndiexnexsaykhuchinsn thimiplaydanhnungepnplayehniyw ehmuxnkbplayomelkulkhxngdiexnexthitddwyexnismtdcaephaathieluxkich dngnn cungsamarthechuxmtxkbchindiexnexthitdiwodyichplayehniyw sticky end ligation aelacathahnathiepntaaehnngthicbkhxngiphremxrinkartha PCR txip dwywithikardngklawni chindiexnexthiidcakkartddwyexnismtdcaephaakcasamarthephimprimanidodyichiphremxrthimiladbebstrngkbswnkhxng adapter rwmkbswnkhxngebsthitaaehnngtdcaephaakhxngexnism xyangirktam canwnchindiexnexthisamarthephimprimanidinkhrawediywknmimak aelaimsamarthcaaeykcakknhruxtrwcsxbodywithithw ip echn kartha dngnnkarsngekhraahiphremxrinkartha AFLP cungephimebsephuxkhdeluxkekhathiplay 3 txcakebsthitaaehnngtdcaephaakhxngexnism ephuxiheluxkcbkbchindiexnexthimiladbebsswnthixyutxcakbriewntdcaephaasxdkhlxngkbebsthiephimekhaipthiplay 3 khxngiphremxrnnethann thaihekidkarephimprimanchindiexnexephiyngbangswnaelasamarthkahndcanwnchindiexnexthitxngkarephimprimanidodycanwnebsthiephimekhaipnnexng thadiexnexkhxngsingmichiwithruxcionmthisuksamiswnprakxbkhxngebsthng 4 chnid G A C T insdswnethakn karephimebsekhathiplay 3 khxngiphemxrephuxkhdeluxk 1 ebscachwyldcanwnchindiexnexthicaephimprimanehluxephiyng 1 in 4 khxngthnghmd thaephimebsephuxkhdeluxk 2 ebs canwnchindiexnexthitrwcsxbidkcaldlngehlux 1 4 2 hrux 1 in 16 khxngchindiexnexthitdidthnghmdethann dngnn cungsamarthkhwbkhumihekidkarephimprimanchindiexnexincanwnthiehmaasmid odycanwnebsthiephimekhaipaetlaebscaldprimanchindiexnexlngehlux 1 4 n khxngthnghmd n khux canwnebssahrbkhdeluxkthiephimkhun inthangptibti txngkarihmicanwnchindiexnexinchwng 50 100 aethb sungepnchwngthisamarthtrwcsxbidodywithixielkothrofrisisin denaturing polyacrylamide gel insingmichiwitthimicionmkhnadelkcaichiphremxrthimikarephimebsephuxkhdeluxkcanwnnxy ephraacanwnchindiexnexthiidcakkartddwyexnismtdcaephaamicanwnnxy inkhnathikartrwcsxbdiexnexkhxngsingmichiwitthimicionmkhnadihyhruxmikhwamsbsxnmak txngichiphremxrthimikarephimebsephuxkhdeluxkcanwnmakkhun ephuxprbcanwnchindiexnexthicaephimprimanihmicanwnphxehmaa aebbkhxngaethbdiexnexthiekidkhuncakkartha PCR odyichiphremxrkhuhnung eriykwa layphimph AFLP AFLP fingerprint dngnnethkhnikh AFLP cungepnwithitrwcsxbwithihnung aethbdiexnexinlayphimphkhxngaetlatwxyangbngbxkthungkhwamaetktangkhxngchindiexnexthitdiddwyexnismtdcaephaa cungsamarthichepnekhruxnghmay eriykwa ekhruxnghmay AFLP AFLP marker ichsuksakhwamhlayhlakkhxngsingmichiwitidechnediywkbekhruxnghmaydiexnexaebbxunhlkkartha AFLPkrabwnkaraebngepnsamkhntxn khnaerk khuxkarnadiexnexmatddwyexnismtdcaephaa 2 chnid niymichexnismthimitaaehnngcdca 6 khuebs sungcatddiexnexthitaaehnnghangknpraman 46 4 096 khuebs eriykwa rare cutter rwmkbexnismthimitaaehnngcdca 4 khuebs sungcatddiexnexthitaaehnnghangknpraman 44 256 khuebs eriykwa frequent cutter aelwechuxmtxchindiexnexkb adapter khxngexnismthngsxngchnid ephuxihepnthicbkhxngiphremxrinkarephimprimanodywithikar PCR inkhntxip kartddiexnexdwyexnismtdcaephaa 2 chnidcathaihidkhnadkhxngchindiexnexphxehmaa aelamikhxdixikhlayprakar dngni exnismtdcaephaathiepn frequent cutter catddiexnexidchinkhnadelk sungcaephimprimaniddiinkartha PCR aelaxyuinchwngthiehmaasmsahrbaeykdwywithixielkothrofrisisodyich denaturing polyacrylamide gel exnismtdcaephaathiepn rare cutter mitaaehnngthicatddiexnexidnxy cungchwyldcanwnchindiexnexthicaephimprimancakkartha PCR lng enuxngcakchindiexnexthiephimprimanidthnghmd hruxekuxbthnghmd epnchindiexnexthimiplaydanhnungepntaaehnngtdkhxngexnismthiepn rare cutter aelaxikdanhnungepn frequent cutter chindiexnexthimiplaythng 2 danepntaaehnngkhxngexnismaebb frequent cutter emuxechuxmtxkb adapter aelwcamilksnaepnladbebssa inverted repeat emuxthukthaihesiysphaphepnsayediywcasamarthklbmacbknexngodyebskhusm ekidepnokhrngsrangaebb stem loop thaihiphremxrimsamarthekhamacbid swnchindiexnexthithuktdodyexnismthiepn rare cutter thng 2 danmkcamikhnadihy cungimsamarthephimprimanidinsphawathiichthdlxng karichexnismtdcaephaa 2 chnid inkartha PCR caichiphremxr 2 chnidechnediywkn thaihsamartheluxktidchlakthiiphremxrchnididchnidhnungid dngnn cungmidiexnexthitidchlakephiyngsayediywemuxnaipaeykkhnadody denaturing polyacrylamide gel diexnexthng 2 sayxaccaekhluxnthiipidrayathangimethakn ekidepnaethbdiexnex 2 aethbkhukn doublet karwiekhraahphlcungyungyak inkrnithimikartidchlakephiyngsayediyw catrwcphbaethbdiexnexephiyngaethbediywthaihwiekhraahidngaykhun karichexnismtdcaephaa 2 chnid chwyihkarprbcanwnchindiexnex thicaephimprimanmikhwamyudhyundi odyprbcanwnebsephuxkhdeluxkthiiphremxrthng 2 chnidrwmkn samarththaihekidlayphimphdiexnexthiaetktangknidcanwnmak odyichkhuphsmkhxngiphremxrthng 2 chnidcanwnnxy echn miiphremxrchnidla 5 aebb cakkarephimebsephuxkhdlxk samarthsranglayphimphdiexnexidthung 25 aebb epntn karichdiexnextdcaephaa xacichchnidthiepn rare cutter thng 2 chnidkid aetcatrwcphbdiexnexcanwnnxy echphaachinthimikhnadelkethann ephraachindiexnexthimikhnadelkcaephimprimaniddikwa cungimkhxyniym exnismtdcaephaathiichmihlaychnid echn EcoRI HindIII Pstl Bglll Xbal 6 cutter aela Sse 83871 8 cutter rwmkb Msel hrux TaqI sungepn 4 cutter exnism MseI mitaaehnngcdcaepn 5 TTAA 3 aela TaqI mitaaehnngcdcaepn 5 TCGA 3 diexnexkhxngyuaekhrioxtswnihycamixngkhprakxbepnebs A aela T canwnmak AT rich exnism MseI cungtddiexnexidkhnadelkkwaexnism TaqI emuxichexnism TaqI chindiexnexthiephimprimanidmkimkhxysmaesmx capraktepnaethbkhnadihysungxyuswnbnkhxngecl dngnncungniymichexnism MseI makkwa ephraatddiexnexidkhnadphxehmaasahrbkarephimprimanodywithi PCR aelakaraeykodyich denaturing polyacrylamide gel sahrbexnismthiepn rare cutter nnichidthwip aetthiichexnism EcoRI knmakenuxngcakmirakhathukaelakartddiexnexmiprasiththiphaphdi odymioxkasphbkartdimsmburnidnxy karechuxmtxdiexnexkb adapter kartddiexnexdwyexnismtdcaephaaaelakarechuxmtxchindiexnexthiidkb adapter samarththaphrxmknid enuxngcak adapter thisngekhraahkhunmann xxkaebbihmiplaythiepndiexnexsayediyw miladbebsepnkhusmkbplayehniywkhxngdiexnexthitddwyexnismtdcaephaathieluxkich aetebskhuthixyuintaaehnngthdmaepnebskhnlachnidkbebsthibriewncdcakhxngexnism dngnnemux adapter ekhaipechuxmtxkbchindiexnexaelw exnismtdcaephaanncaimsamarthtdidxik aetthachindiexnexthithuktdechuxmtxklbipihmcasamarthtdidxik karechuxmtx adapter odymiexnismtdcaephaaxyudwycungimmiphlesiyid aelayngchwyihkartddiexnexekididsmburnxikdwy khnthisxng khuxkarephimprimanchindiexnexbangswnodyichiphremxrthicaephaa iphremxrthiichmiladbebsthangplay 5 ehmuxnkbladbebskhxng adapter txdwyladbebsbriewncdcahruxbriewntdcaephaakhxngexnism aelaephimebsekhaipthiplay 3 xikswnhnungephuxihekidkarkhdeluxkephimprimandiexnexbangchin swnkhxngiphremxrthiehmuxnkb adapter aelabriewncdcakhxngexnism eriykwa common part swnebsthiephimekhaipthiplay 3 eriykwa selective part canwnebsthiephimekhaipthiplay 3 cachwyldcanwndiexnexthicaephimprimanlng odychindiexnexthicaephimprimanidtxngmiladbebsthixyutxkbtaaehnngtdcaephaakhxngexnismsxdkhlxngkbebsthiephimekhaip thaephimebsephuxkhdeluxkmakkhuncanwnchindiexnexbthicaephimcaldlngpraman 4 ethatxthuk ebsthiephimkhun inkarsuksacionmkhnadelkhruxokhlnthixyuinphlasmid khxsmid hrux BAC bacterial artificial chromosome imcaepntxngephimebsephuxkhdeluxk enuxngcakcanwnchindiexnexthiekidcakkartdodyexnismtdcaephaamicanwnnxyxyuaelw singmichiwitthimicionmkhnakimihymak echn aebkhthieriy hrux echuxra caephimebsephuxkhdeluxk 1 2 ebs swnphwkthimicionmkhnadihycaephimebsmakkwa 2 ebsthiiphremxrthngsxngchnid iphremxrthiephimebsephuxkhdeluxkthiplay 3 caeriykwaepniphremxr 1 2 3 aela 4 tamladb echn iphremxrthangplay EcoRI adapter caeriykwa EcoRI 1 EcoRI 2 EcoRI 3 EcoRI 4 epntn kartha PCRodyichiphremxrthiephimebsthiplay 3 makkwa 2 ebs cathaptikiriyaephimpriman 2 khrng khrngaerk eriykwa Preselective amplification aelakartha PCR khrngthi 2 eriykwa selective amplification karthaptikiriya Preselective amplification epnkarephimprimandiexnextnaebbihmakkhun aela chwyihekidkarkhdeluxkephimprimanchindiexnexthithuktxng mikarthdlxngephimprimandiexnexephiyngkhrngediywodyichiphremxrthiephimebsephuxkhdeluxk 1 2 3 aela 4 ebstamladb phbwa canwnchindiexnexthiephimprimanidldlngepnladbcakkarichiphremxraebb 1 2 3 aela 4 aesdngthungprasiththiphaphinkarkhdeluxkthithuktxng aetiphremxr 4 ihphlimsxdkhlxngkn samarthtrwcphbaethbdiexnexcanwnmakthiimtrngkbaethbdiexnexthiekidcakkarephimprimanodyiphremxr 1 2 aela 3 aesdngwaekidkarcbkhukhxngebsthiimthuktxng mismatch intaaehnngthixyuhangcakplay 3 3 ebs hrux ebskhdeluxktwaerkthixyutidkbtaaehnngtdcaephaannexng inkarthdlxngtxma phbwakarephimebsephuxkhdeluxkkhrngediyw 3 ebs kthaihekidkarcbkhuimthuktxngkhxngebsthiephimkhuntwaerksudidechnediywknaetekidinkhwamthita dngnn thatxngkarephimebsephuxkhdeluxktngaet 3 ebskhunip cungtxngichwithiephimprimandiexnex 2 khrng odykhrngaerkichiphremxrthiephimebskhdeluxkephiyng 1 2 ebs aelakhrngthi 2 cungichiphremxrthiephimebskhdeluxktxcakiphremxrthiichephimprimandiexnexinkhrngaerkxik 1 2 ebs rwmebsthiephimephuxkarkhdeluxk 3 4 ebstamthitxngkar karthaptikiriyaephimprimandiexnexepn 2 khn nxkcakepnkarpraknwa karkhdeluxkephimprimanchindiexnexkhxngiphremxrthiichepnipxyangthuktxng aelamiprasiththiphaphsungsudaelw yngchwyld background thiepnphundainlayphimphdiexnexdwy nxkcakniyngxactha Preselective amplification odyichiphremxrthiimmiebskhdeluxk iphremxr 0 idinkrnikarwiekhraahcionmkhnadelk thitxngichiphremxrthiephimebskhdeluxkcanwnnxy ephuxthaihprimandiexnexephimmakkhun aelasamarthtrwcsxbaethbdiexnexidchdecnkhun khnsudthay khuxkarwiekhraahlayphimphdiexnexthiidodythaxielkothrofrisisin denaturing polyacrylamide gel aebbediywkbthiichhaladbebskhxngdiexnex aethbdiexnexthiehmaasminkaraeyk odywithinixyuinchwng 50 100 aethb kartrwcsxbaethbdiexnexthiekidkhunichwithikartidchlakiphremxrchnididchnidhnungdwysarkmmntrngsi hlngcakthaxielkothrofrisisesrcaelw trwcphlodykartha hruxxacichwithitidchlakdwy fluorescent dye aelwtrwcsxbodyichekhruxnghaladbebsaebbxtonmti automated sequencer kid cakkarthitxngtrwcsxbphlkartha AFLP odyichsarkmmntrngsi hruxichekhruxngharladbebsaebbxtonmti thaihekidkhxcakdinhxngptibtikarhlayaehng enuxngcakkhadprasbkarnaelarabbkarptibtinganthiichsarkmmntrngsi hruximsamarthsuxekhruxnghaladbebsxtonmtithimirakhaaephngid cungmikarprayuktichwithitrwcsxb AFLP dwykarodyichophrb Probe thitidchlakdwysarplxdrngsi non radioactive label hruxwithiyxmecldwysilewxrinetrt silver staining sungihphlepnthinaphxic aela samarththaidinhxngptibtikarthangdiexnexthwipkhwamaetktangrahwanglayphimph AFLPkhuxlayphimphdiexnexthiekidcakkartha AFLP milksnaepnlayphimphaebbsum random fingerprint sungichkbdiexnexid kid imkhunkbkhnadaelakhwamsbsxnkhxngcionm samarthprbihekidlayphimphthiehmaasmodykarprbcanwnebskhdeluxkthiplay 3 khxngiphremxrthiich aemwawithikartha AFLP cakhxnkhangyungyak aetphlthiidnbwadi ephraasamarththasaidphlkhngedim reproducible aelasamartheluxkkhuphsmkhxngiphremxridhlayaebb thaihekidlayphimphdiexnexcanwnmak inkarephimprimandiexnexodyiphremxrkhuhnung nncaekidaethbdiexnexcanwnmakinewlaediywkn aebbkhxngaethbdiexnexthiaetktangkninaetlatwxyang hruxthiekidkhun macakkarepliynaeplngebs point mutation mitaaehnngcdcakhxngexnism thaihtaaehnngcdcakhxngexnismhayiphruxekidkhunihm hruxkarepliynaeplngkhxngebsthitaaehnngtidkbtaaehnngcdcakhxngexnism trngswnthimikarephimebsephuxkhdeluxkkhxngiphremxrthiich thaihsamarthhruximsamarthephimprimanchindiexnexdngklawaelwaetkrni hrux xacekidcakmichindiexnexsn khadhayip hrux sxdaethrkekhama deletion insertion inrahwangtaaehnngtdcaephaakhxngexnism phlthiekidkhun khux karmiaethbdiexnexhruximmiaethbdiexnexthitaaehnngnn hruxchindiexnexthiephimprimanidmikhnadepliynip karthaythxdlksnakhxngaethbdiexnexcakkartha AFLP cungmithngaebbthiaesdnglksnakhm dominance odypraktepnkarmihruximmiaethbdiexnex aelaaebbthiaesdnglksnkhmrwmkn codominance odypraktepnaethbdiexnexthimikhnadtangkn odythwipcaphbekhruxnghmay AFLP AFLP marker aebbthiepnlksnakhmmakkwaxangxingZabeau M and P Vos 1993 Selective restriction fragment amplification a general method for DNA fingerprinting European Patent Office publication 0 534 858 A1 bulletin 93 13 Vos P Hogers R Bleeker M phvscikayn 1995 AFLP a new technique for DNA fingerprinting Nucleic Acids Res 23 21 4407 14 doi 10 1093 nar 23 21 4407 PMC 307397 PMID 7501463 surinthr piyaochkhnakul 2009 ekhruxnghmaydiexnex cakphunthansukarprayukt phakhwichaphnthusastr khnawithyasastr mhawithyalyekstrsastr pp 103 122 ISBN 978 974 9934 98 2 Meudt HM Clarke AC minakhm 2007 Almost forgotten or latest practice AFLP applications analyses and advances Trends Plant Sci 12 3 106 17 doi 10 1016 j tplants 2007 02 001 PMID 17303467 brrnanukrm crirtn mngkhlsiriwthna 2552 Differential display PCR saywichawithyasastr khnasilpsastraelawithyasastr mhawithyalyekstrsastr nkhrpthm aehlngkhxmulxunStep through animation of PCR cak Cold Spring Harbor s Dolan DNA Learning Center Adobe Flash required exnismsahrb AFLP thi New England Biolabs